Mykologie Untersuchungsmethoden

Materialgewinnung (variiert nach Mayser)

Die Vorgehensweise bei der Materialgewinnung erfolgt in Abhängigkeit von den befallenen Strukturen (s.a. Mykosen).  

Reinigung: Erfolgt mit 70-prozentigem Äthylalkohol oder Isopropylalkohol. Beseitigung der Anflugflora und der möglichen Begleitkeime. Keine handelsüblichen Desinfektionssprays, da das Kulturwachstum der Pilze hierdurch beeinträchtigt wird! Entnahme der Probe im Randbereich der Hautveränderungen (hier stärkste Schuppung mit der größten Pilzkonzentration). Hinweis: Verwendung von sterilem Instrumentarium (Skalpell, scharfer Löffel, Schere) ist Voraussetzung!

Entnahme aus dem Randbereich mit der stumpfen Seite eines Skalpells. Oberflächliche und grobe Schuppen werden verworfen (häufig nur abgestorbene Pilze und viele Verunreinigungen). Tiefergelegene feine Schuppen kommen zur Untersuchung. Feine Schuppenanteile werden in einem Kunststoffbehälter oder auf einem Blatt Papier für die Untersuchung gesammelt.

Hautmaterial der Zehenzwischenräume kann für die Untersuchungen leicht mit einer Pinzette entnommen werden, um dann weiterhin mykologisch aufgearbeitet zu werden. Zur Erleichterung kann ein Zehenspreizer genommen werden (S.u. Tinea pedum).

Bei ungenügender Materialmenge kräftiger Abstrich der Oberfläche mit einem Kochsalz angefeuchteten Stiltupfer. Dieser wird direkt auf der Kulturplatte ausgestrichen.

Aufbringen auf den Objektträger: Mehrere Partikel des Untersuchungsmaterials werden auf einem Objektträger platziert. 1-2 Tropfen einer 20-30% Kaliumhydroxid-Lösung (KOH;Kalilauge) hinzugeben. Kalilauge mazeriert Haut-, Haar- und Nagelpartikel und macht sie damit transparent. Die eingeschlossenen Pilzelemente werden aufgrund ihrer stärkeren Lichtbrechung mikroskopisch sichtbar. Der Objektträger wird mit einem Deckgläschen abgedeckt. Luftblasen vermeiden! Angefertigte Präparate werden bis zur Durchsicht in einer feuchten Kammer (z.B. in einer geschlossenen Petrischale mit feuchtem Zellstoff) aufbewahrt. Bis  zum Eintreten der erwünschten Transparenz der Hautpartikel wird unterschiedlich lange Zeit benötigt, durchschnittlich etwa 20 Minuten. Bei Nagelmaterial ist etwa 1 Stunde erforderlich. Haare sind rasch nach Zugabe der Kalilauge zu mikroskopieren (Haare zerfallen sehr schnell; eine Zuordnung des Erregers zu einer Wachstumsform -ektotrixisch/endotrixisch- ist dann nicht mehr möglich).

Verkürzung der Mazerationszeit: Kann durch vorsichtiges Erhitzen des Präparates erzielt werden. Dabei nicht bis zum Kochen erhitzen, Bildung von KOH-Kristallen!  Kalilaugenkristalle können falsch positive Ergebnisse verursachen. Wird an Stelle von Kalilauge TEAH (Tetraethylammoniumhydroxid – Fa. Merck) verwendet, so kann das Material sofort mikroskopisch untersucht werden. 

Mikroskopie: Für die mikroskopische Untersuchung wird das Untersuchungsmaterial durch gleichmäßigen Druck auf das Deckgläschen in einer sehr dünnen Schicht gespreitet. Die Beurteilung erfolgt lichtmikroskopisch. Kondensor des Mikroskops absenken. Hierdurch konturenschärferes Bild. Alternativ: Phasenkontrast-Untersuchung.  Alternativ: Anfärbung (Kongorot, Methylenblau, Chlorazol Black) der Pilzzellen.

Nativpräparate bei Pityriasis versicolor (s.u. Pityriasis versicolor) 

Mikroskopische Untersuchung zur Identifizierung auf Speziesniveau: Hierzu eignen sich  Zupfpräparate (1 Trpf Lactophenol auf Objektträger geben, Pilzelemente aus der Kultur abzupfen, auf Objektträger geben und mikroskopieren), das Klebestreifen-Abriss-Präparat (1 Trpf Lactophenol auf Objektträger geben, Pilzelemente aus der Kultur mittels Klebestreifen -leicht aufdrücken-  abnehmen, Klebestreifen auf Objektträger aufkleben und mikroskopieren) oder die Deckglaskultur (aus Petrischale 1,0x1,0x0,5 cm großen Agarwürfel schneiden, auf Objektträger legen, Seitenränder beimpfen, Deckgläschen auflegen, einige Tage bebrüten, dann mikroskopieren).    

Fluoreszenzuntersuchung: Anfärbung der Präparate mit Akridinorange oder Calcofluor White. Farbstoffe  lagern sich an bestimmte Polysaccharide bzw. an das Chitin der Pilze an (humane Keratin wird nur gering angefärbt). Im Fluoreszenzmikroskop  Pilzelemente grünlich leuchtend. Cave: Zellulose (Baumwollfasern) fluoresziert ebenfalls. 

Hefepilzdifferenzierung erfolgt mittels Kultur auf Reisagar.

Hautmaterial der Zehenzwischenräume kann für die Untersuchungen leicht mit einer Pinzette entnommen werden, um dann weiterhin mykologisch aufgearbeitet zu werden. Zur Erleichterung kann ein Zehenspreizer genommen werden (S.u. Tinea pedum).

Histologische Untersuchung: Größere Nagelstücke können gegebenenfalls auch für die histologische Diagnostik verwendet werden. Der histologische Nachweis der Erreger erfolgt mittels PAS-Reaktion.

PCR-achweismethoden: Zusätzlich gibt es die Möglichkeit der Diagnostik mittels der (Multiplex-) Polymerase Ketten Reaktion (polymerase chain reaction, PCR - z.B. EURO-Array Dermatomycosis - Euroimmun, Groß Gronau). Dieses Verfahren besticht durch die hohe Sensitivität und Geschwindigkeit in der Diagnostik (Bieber K et. a. 2021). In dem Verfahren können >50 Pilze erfasst werden

GOÄ Tipps: 

• Abstrichentnahmen: diese werden mit der Ziffer 298 berechnet. GOÄ Nr. 298 kann in derselben Sitzung dann mehrfach berechnet werden, wenn die Gewebeproben aus versch. Körperregionen entnommen und untersucht werden.
• Für die mikroskopische Untersuchung eines Nativpräparates wird die Ziffer 3508 angesetzt.
• Nach einfacher Färbung (z.B. Methylenblau) wird die Ziffer 3509 angesetzt
• Nach differenzierender (stufenweise Verwendung mehrerer Farblösungen, z.B. Giemsa) Färbung wird die 3510 angesetzt
•  Nr. 4711 GOÄ ist für die lichtmikrokopische Untersuchung zum Nachweis von Pilzen im Nativmaterial nach Präparation (z.B. Kalilauge) anzusetzen.
• Nr. 4715 GOÄ ist für die Anzüchtung einer Kultur auf einem einfachen Nährmedium (z.B.Kimmig Agar) anzusetzen.
• Nr. 4717 GOÄ ist für die Anzüchtung einer Kultur auf einem Differenzierungsmedium (z.B. Sabouraud-Dextrose-Agar mit chromogenen Substanzen) anzusetzen.
• Nr. 4715 und 4717 GOÄ sind je Untersuchungsmaterial mehrfach ansetzbar (je verwendetes Nährmedium)
• Nach Anzucht kann die lichtmikroskopische  Untersuchung der angezüchteten Pilze mit der Nr. 4710 GO Ä analog (keine Anfärbung), wenn angefärbt wurde mit der Nr. 4722 beziffert werden. 4722 auch mehrfach je Untersuchung.

1. Bieber K et al. (2021) DNA-Chip basierte Diagnose der Onychomykose und Tineda pedis. JDDG 20:1112-1122
2. Brasch J (2012) Neues zur Diagnostik und Therapie bei Mykosen. Hautarzt 63: 390-395
3. Mayser A (2010) Mykologische Fortbildung, Teil 1: Grundlagen der Mykologischen Diagnostik. Almirall Hermal 21462 Reinbek.
4. Nenoff, P et al. (2014) Mykologie - ein Update Teil 2: Dermatomykosen: Klinisches Bild und Diagnostik. JDDG 12:749-778 
5. Seebacher C et al. (2007) Tinea der freien Haut. J Dtsch Dermatol Ges 11: 921-926