DNA-Polymerase

Mit DNA-Polymerase(n) wird eine Gruppe von Polymerasen bezeichnet, die die Synthese von Polydeoxyribonukleotiden aus Mono-Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) katalysieren und in vivo die grundlegenden Funktionen der DNA-Replikation, der Reparatur und in einigen Fällen der Zelldifferenzierung erfüllen. DNA Polymerasen spielen eine zentrale Rolle bei der DNA-Replikation , also der Herstellung identischer Kopien der DNA.

Beim Menschen (sowie bei allen anderen Säugetieren) kommen fünf DNA-Polymerasen vor: α, β, γ, δ und ε. Es ist anzunehmen, dass die Polymerasen δ und ε für die Replikation entscheidend sind, da sie sich durch hohe Prozessivität und Korrekturlesefunktion (proof reading) auszeichnen. Die Polymerasen α und β zeigen dagegen nur geringe Prozessivität und keine Proofreadingfunktion.

Weiterhin existieren RNA-abhängige DNA-Polymerasen, die die RNA als Matrize nutzen und Mono-Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) anhängen. Diese werden als Reverse Transkriptase bezeichnet. Zu dieser Gruppe gehört auch die Telomerase. Als unabhängige DNA-Polymerase ist nur die terminale Desoxyribonucleotidyltransferase bekannt.

DNA-Polymerasen benötigen neben den Polydeoxyribonukleotiden (dNTPs) ein initiierendes Oligonukleotid (oder Polynukleotid), einen so genannten Primer, der eine Hydroxylgruppe am 3′-Ende trägt, die als Ausgangspunkt für das Kettenwachstum verwendet werden kann. DNA-Polymerasen können die Synthese von Mononukleotiden nicht de novo einleiten. Ein Primer kann ein kurzes oder langes Stück DNA oder RNA sein, das eine freie 3′-OH-Gruppe trägt. Primer stellen der DNA-Polymerase eine doppelsträngige Struktur zur Verfügung, indem sie sich an eine komplementäre Region des DNA- oder RNA-Strangs, die so genannte Matrize, anlagern. Die DNA-Polymerase bewegt sich entlang der DNA- (oder RNA-) Matrize und verlängert den Primer in der Richtung 5′ → 3′ gemäß der Watson-Crick-Basenpaarungsregel, d. h. A paart sich mit T (oder U) und C mit G. Die Polarität der neu synthetisierten Kette ist entgegengesetzt (oder antiparallel) zu der des Templates. Der Einbau eines nicht komplementären Nukleotids wird als "Fehler" betrachtet. Die Fehlerhäufigkeit ist ein wichtiges Kennzeichen einer Polymerase.

Neben der Hauptaktivität 5′ → 3′-Polymerase kann eine DNA-Polymerase mehrere andere Aktivitäten aufweisen, z. B. 5′-Nuklease, 3′ → 5′-Exonuklease und/oder RNase H-Aktivitäten, die für die ordnungsgemäße Funktion in vivo erforderlich sind.

Vorlagenabhängige DNA-Polymerasen besitzen im Allgemeinen mehrere Domänen, die unterschiedliche Aktivitäten haben, aber in vivo koordiniert funktionieren, um eine hohe Polymerisationsrate, maximale Replikationstreue und die Regulierung der Polymeraseaktivität zu gewährleisten. Die häufigste Kombination von Multifunktionen ist die Polymerase- und 3′ → 5′-Exonuklease-Aktivität, wie sie in den DNA-Polymerasen von E. coli, T4 und T7 zu finden ist.

Eine weitere häufige Kombination sind die Polymerase- und RNase-H-Aktivitäten, die in reversen Transkriptasen zu finden sind. Obwohl sie physisch und funktionell eng miteinander verbunden sind, ist jede Funktion in einer eigenen Domäne angesiedelt. So können beispielsweise die 3′ → 5′-Exonuklease- und/oder RNase H-Aktivitäten selektiv gehemmt oder inaktiviert werden, ohne die Polymeraseaktivität zu beeinträchtigen.

Der Beginn der zellulären DNA-Replikation findet bei höheren Eukaryoten an mehreren spezifischen Stellen der DNA statt, die als Replikationsursprünge (Ori) bezeichnet werden. Die Stelle der dsDNA, an der die Replikation stattfindet, wird als "Replikationsgabel" bezeichnet. Aufgrund der Polarität der DNA-Stränge führt die bidirektionale Replikation zu zwei unterschiedlichen Produkten, dem "führenden" und dem "nachlaufenden" Strang, je nach Bewegungsrichtung der Replikationsgabel. Der vordere Strang wird als eine einzige kontinuierliche Kette synthetisiert, während der hintere Strang zunächst als kleine Oligonukleotide, die so genannten Okazaki-Fragmente, synthetisiert wird, die anschließend dann zu einer kontinuierlichen Kette ligiert werden. Kleine RNAs spielen eine wichtige Rolle als natürliche Primer bei der Synthese sowohl des Vorlaufstrangs als auch insbesondere des Nachlaufstrangs.

Funktionelle Konzepte der Polymerase: Prozessivität und Treue.

Die funktionellen Aufgaben der DNA-Polymerasen bei der DNA-Replikation, -Synthese und -Reparatur beruhen auf einer Reihe wichtiger Konzepte, die die enzymatischen Eigenschaften der Polymerasen definieren. Zwei dieser Konzepte, die für die Polymerasen, die die schablonenhafte DNA-Synthese katalysieren, relevant sind, sind Prozessivität und Treue . Prozessivität und Treue einer DNA-Polymerase werden nicht nur durch die koordinierten Aktionen von Polymerase und Polymerase-assoziierten Aktivitäten verbessert, sondern auch durch die Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, den so genannten akzessorischen Proteinen, die mit der DNA-Polymerase einen Replikationskomplex bilden, moduliert.

Prozessivität: Eine an der DNA-Synthese beteiligte DNA-Polymerase kann kontinuierlich gebunden sein (oder auch nicht) und sich schrittweise entlang der Vorlage bewegen. Tatsächlich lassen sich DNA-Polymerasen nach der Zugabe einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden von der Matrize abfallen und binden sich wieder an, um die Polymerisation erneut einzuleiten. Auch die Geschwindigkeit der von den DNA-Polymerasen katalysierten DNA-Kettenverlängerung ist nicht einheitlich. Die Prozessivität ist die durchschnittliche Anzahl der Nukleotide, die von einem Polymerase-Molekül jedes Mal hinzugefügt werden, wenn es eine Vorlage bindet. Die Prozessivität ist eine intrinsische Eigenschaft der Polymerase. Eine Polymerase wird als prozessiv bezeichnet, wenn sie eine lange Vorlage kopiert und dabei ununterbrochenen Kontakt mit ihr hält. Die Anzahl der pro Bindungs-Dissoziations-Ereignis polymerisierten Nukleotide gibt Aufschluss darüber, ob eine Polymerase eine "niedrige" oder "hohe" Prozessivität aufweist. Die Prozessivität wird auch von Faktoren beeinflusst, die sich auf die Sekundärstruktur der DNA und die Konformation des Enzyms auswirken. Die Prozessivität ist also ein Merkmal, das kinetisch mit den Eigenschaften der DNA-Pausen- oder Terminierungsstellen zusammenhängt.

Treue der DNA-Polymerase: Ein weiterer wichtiger Parameter, der eine DNA-Polymerase charakterisiert, ist die Treue, d. h. die Genauigkeit des Nukleotideinbaus oder die Häufigkeit von Fehleinbauten. Die Treue der Polymerase kann mit der Mutationsrate korreliert werden, wie sie typischerweise bei Retroviren wie HIV beobachtet wird. Die Treue einer DNA-Polymerase wird durch die koordinierte Wirkung von Polymeraseaktivität und 3′ → 5′-Exonukleaseaktivität gewährleistet. Die 3′ → 5′-Exonuklease-Aktivität, die auch als proofreading oder editing exonuclease bezeichnet wird, kann entweder ein integraler Bestandteil des Polymerase-Moleküls sein wie in E. coli DNA Pol I oder sie kann mit der Polymerase als Komplex mit mehreren Untereinheiten assoziiert sein wie in E. coli DNA Pol III. Obwohl der genaue Mechanismus noch weiter aufgeklärt werden muss, geht man davon aus, dass eine Polymerase die Unterscheidung zwischen korrekter und inkorrekter Nukleotidbindung und chemischer Versiegelung in erster Linie auf der Grundlage der lokalen DNA-Geometrie und, in geringerem Maße, der Energetik konkurrierender Reaktionen trifft. Daher ist die Treue einer Polymerase größtenteils auf eine kinetische Blockade zurückzuführen, die die Verlängerung der Termini nach einer Nukleotid-Fehleinfügung hemmt.

In der Biotechnologie können in vitro unter geeigneten technischen Bedingungen mit einer etwas anderen Komplexität ebenfalls eine DNA-Synthese durchgeführt werden. Dieser Vorgang wird als Polymerase Kettenreaktion (PCR) bezeichnet.

1. Chatterjee N et al. (2020) A stapled POL kappa peptide targets REV1 to inhibit mutagenic translesion synthesis. Environ Mol Mutagen 61:830–836
2. Ikeh KE et al. (2021) REV1 Inhibition Enhances Radioresistance and Autophagy. Cancers (Basel) 13:5290.
3. Sui X et al. (2013) Autophagy and chemotherapy resistance: A promising therapeutic target for cancer treatment. Cell Death Dis 4:e838.
4. Yamanaka K et al. (2017) Inhibition of mutagenic translesion synthesis: A possible strategy for improving chemotherapy? PLoS Genet 13:e1006842.
5. Li Y et al. (2000) Identification and cloning of two histone fold motif-containing subunits of HeLa DNA polymerase epsilon. J Biol Chem 275:23247-2352.
6. Ogi T et al. (2010) Three DNA polymerases, recruited by different mechanisms, carry out NER repair synthesis in human cells. Mol Cell 37:714-727.
7. Wimmer K et al. (2017) A novel germline POLE mutation causes an early onset cancer prone syndrome mimicking constitutional mismatch repair deficiency. Fam Cancer16: 67-71.