Liquid biopsy

In den letzten Jahren gut etablierte diagnostische Methode zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) oder zirkulierender zellfreier Tumor- DNA (ctDNA) oder zellfreier Tumor-RNA (ctRNA) in Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin (Crowley E et al. 2013). Die Liquid biopsy dient u.a. zur Feststellung des Ansprechens eines Tumors z.B. auf eine Chemotherapie.

Derzeit erfolgt die molekularen Diagnostik in den allermeisten Fällen aus Gewebebiopsien die durch Nadelbiopsie oder einen (häufig aufwendigen) chirurgischen Eingriff gewonnen werden. Die molekulare Diagnostik von DNA-Mutationen wird direkt in frischen Gewebeproben oder häufig in Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE) durchgeführt. Diese Methode ist infolge ihrer Methodik bei vielen Tumorentitäten limitiert und ermöglicht häufig keine zeitliche Querschnittsanalyse.

Die Liquid biopsy aus leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten (Blut, Urin) zum direkten Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) hast diesen wesentlichen methodischen Nachteil nicht, sodass Querschnittsanalysen und repetitive Untersuchungen problemlos möglich sind. Die meisten der verfügbaren Nachweismethoden beruhen auf der Antikörper-basierten Darstellung von Epithelmarkern, so von Adhäsionsmolekülen und/oder versch. Zytokinen.

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs)

Zu den Tumorentitäten bei denen diese Methode bereits eingesetzt wird gehören Malignome der Blase, Brust, Leber, Lunge, Ovarien, Pankreas, Prostata, Dickdarm und das Merkel-Zell-Karzinom (Bardelli A et al. 2017). Bei Patienten mit metastasierten Mamma-, Kolorektal- oder Prostatakarzinom wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen CTC-Zahl und der Prognose nachgewiesen. Dies hat zur Zulassung des „CellSearch CTC-Systems“ (Menarini Silicon Biosystems, San Diego, USA) für diese 3 Entitäten geführt. Inwieweit dies Methode für das Maligne Melanom eine Bedeutung gewinnen wird ist Gegenstand der weiteren Forschung (Gaiser MR et al. 2018).

Für das maligne Melanom wurde das Auftreten von CTCs und ihre Assoziation mit der Tumorlast und ihrem therapeutischen Ansprechen bereits belegt (Rodic S et al. 2014). Hierbei werden Marker für Tyrosinase, MAGE-A3,MART-1 (Melan-A), PAX3 (paired box3) GalNac-T (polypdeptide-N-acetylgalactosaminyltransferase), MCAM (CD146) eingesetzt.

Die unterschiedlichen Strategien bei den versch. Malignomen erfordern unterschiedliche Stratifizierungen von Patienten für geeignete Behandlungen oder auch zur Überwachung von Langzeit-Respondern auf Rezidive sowie von Patienten ohne Hinweise auf eine Tumorprogression (NED-Patienten = no evidence of progression). 

Zellfreie ctDNA

Die  blutbasierte zellfreie DNA (cell-free DNA oder cfDNA) und zellfreie RNA (cell-free RNA oder cfRNA) werden zusammenfassend als „CNAPS“, als  zirkulierende Nukleinsäuren in Plasma und Serum (CNAPS = circulating nucleic acids in plasma and serum) bezeichnet. Die Hauptquelle der cfDNA im Körper ist die passive Freisetzung aus Zellen, durch Mechanismen wie Apoptose und Nekrose, sowie aktive Sekretion aus lebenden Zellen. Bei Malignomen ist die resultierende zirkulierende cell-free Tumor-DNA (ctDNA) durch genetische Defekte, wie Mutationen (für das maligne Melanom BRAF, NRAS; für andere Malignomen Mutationen bei EGFR, PIK3CA, KRAS, BRAF, TP53, HER2, GNA11, KIT, MAP2K1, NRB) Chromosomenaberrationen, anomale epigenetische Muster wie z.B methylierter DNA gekennzeichnet. Die drei häufigsten Nachweismethoden sind digitale PCR (Quantifizierung einer Ziel-DNA in einer Probe), BEAMing und allelspezifische Ligations-PCR (LPCR) (Gaiser MR et al. 2018).

Die genetischen Defekte in der ctDNA sind in hoher Übereinstimmung identisch mit denen im Tumorgewebe, und grundverschieden von der zirkulierenden DNA aus gesunden Gewebe. Im Blut scheint die ctDNA instabiler zu sein als die physiologische DNA. Die Halbwertszeit der zellfreien Tumor-DNA beträgt 144 min (Diehl F et al. 2008). Sie wird von Milz und v.a. von Leber und Nieren aus dem Blutkreislauf herausgefiltert.

Andere Bestandteile des Blutes, die als potenzielle Biomarker ebenfalls zur Tumordiagnostik herangezogen werden können, umfassen miRNA und extrazelluläre zirkulierende Vesikeln (EV) wie z.B. die 50-100nm großen Exosomen.

Die Analyse von zellfreier fetaler DNA ist inzwischen ein etabliertes Verfahren zur nicht-invasiven Pränataldiagnostik (NiPt). Die Untersuchung der fetalen DNA im Blut der Mutter kann Punktmutationen und Aneuploidie bereits 7 Wochen nach der Empfängnis diagnostizieren. Zirkulierende fetale DNA wird nicht durch die Niere ausgeschieden.

Der klinische Nutzen von ctDNA-Analysen in der Onkologie beinhaltet:

• Beurteilung der molekularen Heterogenität 
• Identifizierung von spezifischen genomischen Veränderungen für personalisierte Behandlung (Gaiser MR et al. 2018)
• Überwachung der Tumorlast
• Früherkennung von Arzneimittelresistenz des Melanoms (Mirzaei H et al. 2016)
• Aufklärung von Resistenzmechanismen
• Blutbasierte Ersatzmethode für die klassische Gewebsbiopsie

1. Bardelli A et al. (2017) Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer cell 31: 172-179
2. Crowley E et al. (2013) Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol 10: 472-484.
3. Diaz LA et al. (2014) Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J Clin Oncol 32: 579-586.
4. Diehl F et al. (2008) Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 14:985-990. 
5. Francis G et al. (2015) Circulating cell-free tumour DNA in the management of cancer. Int J Mol Sci. 15: 14122-1442.
6. Gaiser MR et al. (2018) Liquid biopsy to monitor melanoma patients. J Dtsch Dermatol Ges 16:405-414. 
7. Gold B et al. (2015) Do circulating tumor cells, exosomes and circulating tumor nucleic acids have clinical utility? J Mol Diagn 17: 210-224.
8. Mirzaei H et al. (2016) MicroRNAs as potential diagnostic and prognostic biomarkers in melanoma. Eur J Cancer 53:25-32. 
9. Qin Y et al. (2016) Cell-free circulating tumor DNA in cancer. Chin J Cancer 35: 36.
10. Rodic S et al. (2014) Detection methods of circulating tumor cells in cutaneous melanoma: a systematic review. Crit Rev Oncol Hematol 91:74-92. 
11. Sorich et al. (2015)  Extended RAS mutations and anti-EGFR antibody survival benefit in metastatic colorectal cancer. Annals of Oncology 26: 13-21.