RISA

RISA ist das Akronym für „rRNA intergenic spacer analysis“. RISA steht für eine Methode zur Analyse mikrobieller Proben, die Schätzungen der mikrobiellen Vielfalt und der Zusammensetzung der Gemeinschaften ermöglicht, ohne die Verzerrungen, die bei kulturbasierten Ansätzen auftreten, oder den Arbeitsaufwand, der mit der Erstellung von Small-Subunit-rRNA-Genklonbibliotheken verbunden ist (Fisher MM et al. 1999).

RISA wurde ursprünglich zum Vergleich der Diversität in Böden und zur Untersuchung der mikrobiellen Diversität in der Rhizosphäre und in der Meeresumwelt eingesetzt (Fisher MM et al. 1999). Die Methode umfasst die PCR-Amplifikation der intergenen Region zwischen der kleinen (16S) und der großen (23S) Untereinheit der rRNA-Gene im rRNA-Operon aus der gesamten bakteriellen Gemeinschafts-DNA mit Oligonukleotid-Primern, die auf konservierte Regionen in den 16S- und 23S-Genen ausgerichtet sind.

Die intergene Region 16S-23S, die je nach Bakterienart für tRNAs kodieren kann, weist sowohl in der Länge als auch in der Nukleotidsequenz eine erhebliche Heterogenität auf. Beide Arten der Variation wurden ausgiebig zur Unterscheidung von Bakterienstämmen, auch für mykologische Proben  genutzt. Bei RISA wird die Längenheterogenität des intergenen Spacers ausgenutzt. Das PCR-Produkt (ein Gemisch von Fragmenten, die von Mitgliedern der Gemeinschaft stammen) wird in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, und die DNA wird durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Das Ergebnis ist ein komplexes Bandenmuster, das ein gemeinschaftsspezifisches Profil liefert, wobei jede DNA-Bande mindestens einem Organismus in der ursprünglichen Assemblage entspricht.

Beim automatisierten Ansatz sind die ersten Schritte der DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation die gleichen wie bei RISA, außer dass die PCR mit einem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidprimer durchgeführt wird (Porcellato D et al. 2014). Der elektrophoretische Schritt wird anschließend mit einem automatisierten System durchgeführt, das eine Laserdetektion der fluoreszierenden DNA-Fragmente ermöglicht. Die ARISA-PCR kann DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 1.400 bp erzeugen.

1. Fisher MM et al. (1999) Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Appl Environ Microbiol 65:4630-4636.
2. Johnston-Monje D et al. (2020) Botanical microbiomes on the cheap: Inexpensive molecular fingerprinting methods to study plant-associated communities of bacteria and fungi. Appl Plant Sci. 8:e11334.
3. Porcellato D et al. (2014) Application of ARISA to assess the influence of salt content and cation type on microbiological diversity of Cheddar cheese. Lett Appl Microbiol 59:207-216.
4. Saro C et al. (2018) Comparison of automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) techniques for analysing the influence of diet on ruminal bacterial diversity. Arch Anim Nutr 72: 85-99.