Reverse Transkriptase

Die Reverse Transkriptase ist eine von RNA abhängige Polymerase, die 1970 in vielen Retroviren wie dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und dem Aviären Myeloblastose-Virus (AMV) entdeckt wurde.

Die Reverse Transkriptase katalysiert die Umwandlung von RNA-Molekülen als Matrize in eine DNA-Doppelhelix und ist ein sehr nützliches Werkzeug für die Forschung im Bereich der Molekularbiologie. Reverse Transkriptasen werden häufig zur Herstellung von komplementären DNA-Bibliotheken (cDNA) aus verschiedenen exprimierten mRNAs verwendet und dienen in Kombination mit der Polymerase-Kettenreaktion, der sogenannten RT-PCR, auch zur Quantifizierung des Niveaus der mRNA-Synthese. Die reverse Transkriptase enthält drei enzymatische Aktivitäten: (1) RNA-abhängige DNA-Polymerase, (2) RNase H und (3) DNA-abhängige DNA-Polymerase. Zunächst synthetisiert die RNA-abhängige DNA-Polymerase einen DNA-Strang, der komplementär zum RNA-Template ist. Anschließend entfernt RNase H den RNA-Strang aus der RNA-DNA-Hybriddoppelhelix. Dann schließt die DNA-abhängige DNA-Polymerase die doppelsträngige DNA-Synthese ab.

Im Gegensatz zu anderen DNA-Polymerasen verfügt die reverse Transkriptase (RT) nicht über eine Korrekturfunktion und weist daher während der DNA-Synthese hohe Fehlerraten auf, bis zu einem Fehler bei 2000 Basenintegrierungen. Die hohen Fehlerraten der viralen reversen Transkriptasen bieten einen selektiven Vorteil für ihr Überleben im Wirtssystem.

Reverse Transkriptase und Retroviren: Retroviren bestehen aus einem RNA-Genom, das in einer Proteinhülle enthalten ist, die wiederum von einer Lipidhülle umschlossen ist. Das Retrovirus-Genom besteht in der Regel aus drei Genen: dem gruppenspezifischen Antigen-Gen (gag), dem Polymerase-Gen (pol) und dem Hüllgen (env). Das pol-Gen kodiert die drei Enzyme – Protease, Reverse Transkriptase und Integrase –, die die Schritte der retroviralen Infektion katalysieren. Sobald sich ein Retrovirus in einer Wirtszelle befindet (ein Prozess, der durch eine Protease vermittelt wird), übernimmt es die genetische Transkriptionsmaschinerie des Wirts, um ein DNA-Provirus zu konstruieren. Dieser Prozess, die Umwandlung von retroviraler RNA in provirale DNA, wird durch die reverse Transkriptase katalysiert und ist für die Insertion der proviralen DNA in die Wirts-DNA notwendig – ein Schritt, der durch das Integraseenzym eingeleitet wird.

1. Die retrovirale DNA-Synthese ist absolut abhängig von den zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten der Reverse Transkriptase (RT): einer DNA-Polymerase, die entweder RNA oder DNA als Matrize verwenden kann, und einer Nuklease, die Ribonuklease H (RNase H) genannt wird und spezifisch für den RNA-Strang von RNA:DNA-Duplexen ist. Obwohl eine Rolle anderer Proteine nicht ausgeschlossen werden kann und es wahrscheinlich ist, dass bestimmte virale Proteine (z. B. Nukleokapsid, NC) die Effizienz der reversen Transkription erhöhen, können alle enzymatischen Funktionen, die zur Vervollständigung der Reihe von Schritten bei der Erzeugung einer retroviralen DNA erforderlich sind, entweder der DNA-Polymerase oder der RNase H von RT zugeschrieben werden. Es wird angenommen, dass der Prozess der retroviralen DNA-Synthese dem in Abbildung 2 dargestellten Schema folgt:
2. Die Minusstrang-DNA-Synthese wird mit dem 3'-Ende einer teilweise entfalteten Transfer-RNA initiiert, die an die Primer-Bindungsstelle (PBS) in der genomischen RNA als Primer angelagert ist. Die Minusstrang-DNA-Synthese schreitet fort, bis das 5'-Ende der genomischen RNA erreicht ist, wodurch ein DNA-Zwischenprodukt von diskreter Länge entsteht, das als Minusstrang-Strong-Stop-DNA (–sssDNA) bezeichnet wird. Da sich die Bindungsstelle für den tRNA-Primer in der Nähe des 5'-Endes der viralen RNA befindet, ist die –sssDNA relativ kurz und liegt in der Größenordnung von 100–150 Basen
3. Nach dem RNase-H-vermittelten Abbau des RNA-Strangs des RNA:–sssDNA-Duplex bewirkt der erste Strangtransfer, dass die –sssDNA an das 3'-Ende einer viralen genomischen RNA angelagert wird. Dieser Transfer wird durch identische Sequenzen vermittelt, die als wiederholte (R) Sequenzen bekannt sind und sich am 5'- und 3'-Ende des RNA-Genoms befinden. Das 3'-Ende der –sssDNA wurde von den R-Sequenzen am 5'-Ende des viralen Genoms kopiert und enthält daher Sequenzen, die zu R komplementär sind. Nachdem die RNA-Vorlage entfernt wurde, kann sich die –sssDNA an die R-Sequenzen am 3'-Ende des RNA-Genoms anlagern. Die Annealing-Reaktion scheint durch das NC erleichtert zu werden.
4. Sobald die –sssDNA auf das 3'-R-Segment der viralen RNA übertragen wurde, wird die Minusstrang-DNA-Synthese wieder aufgenommen, begleitet von der Verdauung des Matrizenstrangs durch RNase H. Dieser Abbau ist jedoch nicht vollständig.
5. Das RNA-Genom enthält einen kurzen Polypurintrakt (PPT), der relativ resistent gegen den Abbau durch RNase H ist. Ein definiertes RNA-Segment, das von den PPT-Primern abgeleitet ist, dient als Startpunkt für die Plusstrang-DNA-Synthese. Die Plusstrang-Synthese wird angehalten, nachdem ein Teil der Primer-tRNA revers transkribiert wurde, wodurch eine DNA entsteht, die als Plusstrang-Strong-Stop-DNA (+sssDNA) bezeichnet wird. Obwohl alle Stämme von Retroviren einen definierten Plusstrang-Primer aus dem PPT generieren, generieren einige Viren zusätzliche Plusstrang-Primer aus dem RNA-Genom.
6. RNase H entfernt die Primer-tRNA und legt Sequenzen in der +sssDNA frei, die komplementär zu Sequenzen am oder in der Nähe des 3'-Endes der Plusstrang-DNA sind.
7. Das Annealing der komplementären PBS-Segmente in der +sssDNA und der Minusstrang-DNA stellt den zweiten Strangtransfer dar.
8. Die Plus- und Minusstrangsynthesen werden dann abgeschlossen, wobei die Plus- und Minusstränge der DNA jeweils als Matrize für den anderen Strang dienen.

1. Moelling K (1974) Characterization of reverse transcriptase and RNase H from friend-murine leukemia virus. Virology 62:46-59.
2. Verma IM (1977) The reverse transcriptase. Biochim Biophys Acta 473:1-38.
3. Wu AM , Gallo RC (1975). Reverse transcriptase. CRC Crit Rev Biochem 3:289-347.