Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

Mit Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, abgekürzt RFLP (engl.: Restriction Fragment Length Polymorphism) wird eine Technik bezeichnet, bei der Organismen durch Analyse und Vergleich von Mustern, die aus der Spaltung ihrer DNA stammen, unterschieden werden können.

Unterscheiden sich zwei Organismen im Abstand zwischen den Spaltstellen einer bestimmten Restriktionsendonuklease, so ist die Länge der entstehenden Fragmente unterschiedlich Rudner R et al. 1994). Die Ähnlichkeit der erzeugten Muster kann zur Unterscheidung von Arten (und sogar Stämmen) verwendet werden (Amélia Camarinha-Silva et al. 2012).

Bei dem Verfahren werden DNA-Fragmente enzymatisch (durch Restriktionsenzyme) geschnitten, mit Hilfe einer Gelelektrophorese und ihrer Länge nach geordnet. Sie werden dadurch mit anderen DNA-Proben vergleichbar.

RFLP ermöglicht den Nachweis von Polymorphismen auf der Ebene der DNA-Sequenz. Änderungen in den DNA– Fragmenten sind vor allem auf Basenaustauschmutationen in den Erkennungsstellen für die jeweils eingesetzten Enzyme zurückzuführen. Es können aber auch Umlagerungen innerhalb der DNA, Insertionen, Deletionen oder Duplikationen zu einem RFLP führen. Im Falle einfacher Basenaustausche wird immer dann ein Polymorphismus gefunden, wenn Basen innerhalb einer Erkennungssequenz des gerade benutzten Restriktionsenzyms betroffen sind. Der mit diesen Veränderungen einhergehende Verlust oder das neue Auftreten einer Erkennungssequenz geht bei Spaltung genomischer DNA mit dem Verlust bzw. dem Auftreten eines neuen DNA-Fragments und der Verlängerung oder Verkürzung anderer Fragmente einher.

Die RFLP-Methode findet in der Kriminaltechnik oder bei Vaterschaftstests Anwendung. Sie war die erste kostengünstige Methode zum Vergleich der Verwandtschaft zweier Proben, wird aber zunehmend durch andere biochemische Methoden wie die DGGE bzw. TGGE, die Phospholipid-Analyse, die Polymerasekettenreaktion (teilweise mit DNA-Sequenzierung), das RAPD, die STR-Analyse, die SSCP-Analyse oder auch Weiterentwicklungen der RFLP wie AFLP, T-RFLP, ARISA, ARDRA ersetzt.

Eine Variante der RFLP mit rDNA ist das Ribotyping.

Eine speziellere Anwendung ist die terminale RFLP (T-RFLP). Dabei werden die Zielgene in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem (oder beiden) fluoreszenzmarkierten Primer(n) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte werden mit einem Restriktionsenzym verdaut und durch einen automatisierten Sequenzer analysiert.

Die T-RFLP- Technik des amplifizierten Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus wird inzwischen auch zur Analyse von Polymorphismus bei bakteriellen und mykologischen Proben eingesetzt (Masiga DK et al. 2000; Verrier J et al. 2019).  So erwies sich der T-RFLP-Test als hochempfindlich und spezifisch und ermöglicht den schnellen Nachweis und die direkte Identifizierung von Dermatophyten in der ärztlichen Praxis (Verrier J et al. 2019).

1. Amélia Camarinha-Silva et al. (2012) Validating T-RFLP as a sensitive and high-throughput approach to assess bacterial diversity patterns in human anterior nares. FEMS Microbiology Ecology 79: 98–108.
2. Didehdar M et al. (2016) Characterization of clinically important dermatophytes in North of Iran using PCR-RFLP on ITS region. J Mycol Med 26:345-350.
3. Masiga DK et al. (2000) Amplified restriction fragment length polymorphism in parasite genetics. Parasitol Today 16:350-353.
4. Rudner R et al. (1994) Determinations of restriction fragment length polymorphism in bacteria using ribosomal RNA genes. In: Methods in Enzymology. Band 235:184–196
5. Verrier J et al. (2019) PCR-terminal restriction fragment length polymorphism for direct detection and identification of dermatophytes in veterinary mycology. Med Mycol 57:447-456.